• работать с небольшим исходным количеством ДНК,
• контролировать длину секвенируемых фрагментов,
• оптимизировать эксперимент для максимальной производительности,
• проводить таргетное секвенирование.

Особенности набора:

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Пробоподготовка заключается в опциональной фрагментации ДНК с последующей достройкой концов до тупых и присоединением 3’-dA. К 3’-dA лигируются олигонуклеотиды, содержащие сайты связывания ПЦР-праймеров. ДНК амплифицируется, и к ампликонам присоединяются сиквенсные адаптеры.

Стадия ПЦР зависит от исходного количества ДНК и желаемой длины ампликонов. Рекомендуемый протокол ПЦР рассчитан на 100 нг исходной ДНК.

Длина рида составляет в среднем около 2 килобаз и зависит не столько от процессивности Taq-полимеразы, сколько от особенностей пробоподготовки. Но при этом максимальная длина рида выше, чем при использовании набора Rapid PCR Barcoding Kit и может достигать 10 килобаз.

Пользователь также может использовать метод ПЦР с 2 парами праймеров (nested PCR), при этом одна пара праймеров — пользовательские праймеры к определённой последовательности ДНК, а вторая — бар-кодированные праймеры из набора. 5’-концы пользовательских праймеров должны быть комплементарны 3’-концам бар-кодированных праймеров.

Набор позволяет работать с ДНК, содержащей примеси, которые снижают эффективность получения библиотеки. Это происходит благодаря стадии ПЦР. Но необходимо учитывать, что амплификация разных фрагментов может идти с разной эффективностью.

Если исходное количество ДНК менее 1 пг, рекомендуется полногеномная амплификация.

В состав PCR Sequencing Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Условия хранения: -20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter),
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546),
• ДНК-лигаза NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367),
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051),
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620),
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581),
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2X (New England Biolabs M0287),
• свежеприготовленный 70% этанол,
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Опционально:

• экзонуклеаза I (New England Biolabs M0293),
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018),
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG),
• магнитный штатив (Диаэм 3336),
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L),
• амплификатор,
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062),
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам,
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный,
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100),
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).