Набор предназначен для секвенирования двухцепочечной ДНК. Это наиболее универсальный набор из всех, предлагаемых Oxford Nanopore Technologies. С помощью набора Ligation Sequencing Kit можно:

• получить максимальную производительность секвенирования,
• контролировать длину секвенируемых фрагментов.

Для данного набора предлагается множество протоколов пробоподготовки библиотек из различного исходного материала (геномная ДНК, плазмидная ДНК, ампликоны) и для различных задач (геномное секвенирование de novo, ресеквенирование, таргетное секвенирование, мультиплексное секвенирование и т.д.). Процесс пробоподготовки заключается в достройке концов ДНК, пришивке 3’-концевой dA и лигировании к ней адаптеров.

Особенности набора

время пробоподготовки	60 минут
требуемое количество ДНК	1000 нг двухцепочечной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	опциональная, рекомендуется при количестве исходной ДНК менее 500 нг
длина рида	зависит от длины исходных фрагментов
производительность	2 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	Ligation Sequencing, Premium whole genome amplification, Sequence capture *
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D, FLO-MIN107

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор оптимизирован для высокопроизводительного секвенирования. Для максимальной производительности рекомендуется получать библиотеку из 100-200 фмоль высокомолекулярной ДНК. Также важна степень чистоты ДНК, загрязнения существенно снижают производительность. Рекомендуется использовать наноспектрофотометр для оценки степени чистоты ДНК по следующим критериям:

• A260/A280 = 1,8,
• А260/А230 = 2 - 2,2.

Можно секвенировать библиотеки, полученные с помощью Ligation Sequencing Kit из меньшего количества ДНК или ДНК низкого качества, но это существенно уменьшает производительность секвенирования. Частично можно улучшить библиотеку с помощью стадии ПЦР: происходит обогащение библиотеки при малом стартовом количестве ДНК, а также снижается влияние примесей за счёт разведения образца. Но, если ПЦР является неотъемлемой частью пробоподготовки, рекомендуется использовать PCR Sequencing Kit или Rapid PCR Barcoding Kit.

Аналогично, если планируется регулярно секвенировать ампликоны или кДНК, рекомендуется использовать соответствующие наборы — PCR Sequencing Kit или, для секвенирования кДНК, cDNA-PCR Sequencing Kit и Direct cDNA Sequencing Kit.

Набор Ligation Sequencing Kit может быть использован для мультиплексного секвенирования. Для этого необходимы дополнительные наборы Native Barcoding Expansion 1-12 и 13-24 (для мультиплексирования без стадии ПЦР) или PCR Barcoding Expansion 1-12 и 1-96 (для мультиплексирования со стадией ПЦР).

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter),
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546),
• ДНК-лигаза NEBNext Quick Ligation Module (New England Biolabs E6056),
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051),
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C),
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581),
• свежеприготовленный 70% этанол.

Опционально:

• набор для репарации ДНК NEBNext FFPE Repair Mix (New England Biolabs M6630),
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018),
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG),
• магнитный штатив (Диаэм 3336),
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L),
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834),
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062),
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам,
• термоконтейнер со льдом,
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227),
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100),
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C),
• система для препаративного электрофореза BluePippin.