Набор для оценки пролиферации клеток XTT позволяет количественно измерять количество живых клеток в пробе за 1 этап, анализ результатов с помощью ИФА-фотометра, чувствительность от 5000 клеток на лунку, содержит раствор соли тетразолия XTT (10 х 5 мл) и реагенты для активации (2 х 0.5 мл), рассчитан на 1000 измерений в 96-луночных планшетах, хранение при -20 ⁰С, транспортировка на сухом льду, срок годности - минимум 1 год.

Потребность в надежных, чувствительных и количественных методах анализа, которые позволили бы анализировать большое количество образцов, привела к разработке различных методик, таких как включение радиоактивно-меченого ³Н-тимидина в ДНК или использование 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU), как замену радиоактивного тимидина для мечения ДНК в живых клетках. Эти методы имеют ряд недостатков, такие как работа с радиоактивными материалами и сложность исполнения. В 1950-х годах исследователи начали использовать соли тетразолия, в том числе МТТ. Данная методика основана на том, что живые клетки преобразуют соли тетразолия в окрашенные соединения формазана. Её биохимические механизмы основаны на активности митохондриальных ферментов, которые инактивируются вскоре после гибели клетки. Этот подход оказался очень эффективным при оценке жизнеспособности клеток. Колориметрический метод с использованием соли тетразолия XTT был впервые описан Scudiero P.A. в 1988 году. Использование XTT приводило к образованию растворимого красителя, в то время как при использовании МТТ образуются нерастворимые соединения формазана, которые необходимо растворять для последующего измерения. Несмотря на то, что МТТ может лучше метаболизироваться многими клеточными линиями, XTT также хорошо восстанавливается клетками в присутствии феназин метасульфата (ФМС). При этом присутствие ФМС не влияет на ход обратной реакции. Использование XTT значительно упрощает протокол и является отличным решением для количественной оценки жизнеспособности клеток без использования радиоактивных изотопов. Данный набор был разработан для анализа изменений в пролиферации клеток в ответ на различные ростовые факторы, цитокины и питательные компоненты. Кроме того, он подходит для измерения цитотоксичности различных веществ, таких как фактор некроза опухолей (ФНО) или других ингибиторов роста. XTT может быть использован как нерадиоактивная замена цитотоксических тестов, основанных на высвобождении ⁵¹Cr из клеток, без потери чувствительности.

Принцип действия

Оценка пролиферации клеток широко используется в клеточной биологии для исследования ростовых факторов, цитокинов или компонентов культуральных сред. Методы оценки пролеферации применяются также в скрининге цитотоксических веществ и исследованиях активации лимфоцитов. Для определения количества жизнеспособных клеток в наборе для оценки пролиферации клеток XTT используется 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид (XTT). Только в живых клетках митохондрии способны уменьшать количество растворенного XTT с формированием водорастворимого оранжевого красителя. Таким образом, концентрация красителя пропорциональна количеству метаболически активных клеток.

Основные преимущества набора для оценки пролиферации клеток XTT от Applichem

• Безопасность: не используются радиоактивные изотопы,
• точность: интенсивность окрашивания пропорциональна количеству клеток в каждой лунке,
• простота использования: одноэтапный процесс, результаты в течение 2 - 5 ч,
• содержит XTT и реагенты для активации. Дополнительные реактивы или отмывки не требуются,
• анализ результатов в планшетных ИФА-фотометрах: большое количество образцов измеряется одновременно,
• чувствительность: допустима низкая концентрация клеток в лунке (~5000) .

XTT-тест значительно упрощает измерения клеточной пролиферации и жизнеспособности.

Протокол включает культивирование клеток в 96-луночном планшете, добавление XTT-реагента и последующую инкубацию в течение 2 - 24 часов. Во время инкубации (обычно в течение 2 - 5 часов) среда приобретает оранжевый цвет, интенсивность которого может быть измерена с помощью спектрофотометра.

Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству метаболически активных клеток, т.е. чем больше таких клеток в лунке, тем активнее в ней митохондриальные ферменты и тем выше концентрация образовавшегося красителя (краситель растворим в воде и его интенсивность может быть измерена сразу после теста). Использование планшетов и ИФА-анализатора позволяет тестировать большое количество образцов одновременно и сразу получать результаты.

Состав набора

• Раствор XTT (10 x 5мл),
• реагент для активации (2 x 0.5мл), содержащий ФМС (феназин метасульфат)

Оба раствора следует хранить замороженными и не подвергать воздействию света. Чтобы избежать многократного замораживания-оттаивания рекомендуется разделить растворы на аликвоты после первой разморозки.

Замечание: Если в растворе присутствует осадок, нагрейте его до 37C и размешайте на вортексе до растворения.

Стабильность при хранении

Для оценки стабильности испытания проводились с наборами, выпущенными до 20-ти месяцев назад (с одинаковым лотом 703602) в сравнении с новыми стандартными наборами. На графике показаны образцы, протестированные после 17 и 20 месяцев соответственно. Клетки VERO культивировали в 96-луночных планшетах в течение 24 часов. Затем на клетки воздействовали увеличеной концентрацией BHA в течение 24 ч и их жизнеспособность была измерена с помощью набора для оценки пролиферации клеток XTT.