Набор реактивов для обратной транкрипции с MMLV–RH представляет собой полную систему для эффективного синтеза первой цепи кДНК с использованием в качестве матрицы мРНК или суммарной РНК. Набор содержит все необходимые компоненты для проведения обратной транскрипции: обратную транскриптазу MMLV–RH, два варианта 5? ОТ-буфера, смесь dNTP, раствор ДТТ, растворы олиго(dT)₁₆ праймера и случайного гексапраймера, а также свободную от РНКаз воду.

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

Кроме обратной транскриптазы, набор содержит два типа буфера на основе KCl и (NH₄)₂SO₄, оптимизированные для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с любых матриц РНК, в том числе содержащих участки повышенной сложности (сильно структурированные или GC-богатые).

Олиго(dT)₁₆ праймер и случайный гексапраймер позволяют более узконаправленно подходить к обратной транскрипции интересующих типов или участков РНК. Случайный гексапраймер неспецифически связывается с РНК-матрицей и используется для синтеза кДНК со всех типов РНК в составе суммарной РНК. Олиго(dT)₁₆ праймер селективно отжигается на полиадениновых последовательностях РНК, обеспечивая синтез кДНК только с мРНК, содержащих поли(А)-3’-конец. Также можно использовать специфичные праймеры для синтеза определённой последовательности.

Состав набора

Компонент	Кат. #
	1967.0050	1959.0250
MMLV-RH ревертаза, 100 ед. акт./ мкл*	1 ? 50 мкл (5000 ед.акт.)	2 ? 250 мкл (25000 ед.акт.)
5? ОТ-буфер (KCl)	1 ? 220 мкл	3 ? 400 мкл
5? ОТ-буфер ((NH4)2SO4)	1 ? 220 мкл	3 ? 400 мкл
20? смесь dNTP (10 мМ каждого)	1 ? 120 мкл	2 ? 300 мкл
Дитиотреитол	1 ? 110 мкл	2 ? 260 мкл
Случайный гексапраймер, 20 мкМ	1 ? 50 мкл	1 ? 260 мкл
Олиго(dT) праймер, 20 мкМ	1 ? 50 мкл	1 ? 260 мкл
Вода, обработанная ДЭПК	3 ? 600 мкл	5 ? 1.8 мл

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при +37 °С.

Источник
Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего делеционный вариант гена обратной транскриптазы MMLV.

Буфер для хранения:
50 мМ Трис-HCl, pH 8.0 (при +25°C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50 % (v/v) глицерин и 0.1 % (v/v) NP-40.

5? ОТ-буфер (KCl):
250 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25°C), 250 мM KCl, 20 мМ MgCl₂, стабилизаторы.

5? ОТ-буфер ((NH₄)₂SO₄):
250 мM Трис-НCl, рН 8.5 (при +25°C), 100 мM (NH₄)₂SO₄, 20 мМ MgCl₂, стабилизаторы.

Область применения:

• Синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
• Синтез кДНК для клонирования.
• Получение меченых кДНК-зондов для микрочипов (microarray).
• Мечение ДНК.
• Анализ РНК с помощью праймер-экстеншн.

Хранение и транспортировка:
при -20°С, не более 50 циклов замораживания-размораживания.



1967_Набор реактивов для обратной транскрипции с MMLV, инструкция, Диаэм, русск., стр. 3