• Максимальная нагрузка ДНК на дорожку:
• 10 мкг фрагментированной геномной ДНК,
• 2 мкг ДНК определённого размера,
• минимальная нагрузка ДНК:
• от нескольких нг фрагментированной геномной ДНК,
• 50 нг ДНК определённого размера,
• максимальная нагрузка белка — 3,5 мкг,
• максимально возможное количество получаемого образца на выходе — 40 мкл,
• длина волны возбуждения, нм — 470,
• длина детекции, нм — 525,
• источник света — светодиоды LED,
• напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза,
• ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3,
• точность и воспроизводимость выделения, % — 5-10, в зависимости от геля,
• точность (режим постоянного тока), % - >,93,
• воспроизводимость (режим постоянного тока), % - >,92,
• минимальное распределение по размерам, % - 8,
• выход образца, % — 50-80,
• габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18,
• вес, кг — 7.

Области применения:

• приготовление библиотек при проведении NGS на секвенаторах ДНК HiScan SQ, HiSeq 2000, MiSeq (Illumina),
  5500 xl W, 5500w, Ion Torrent IonProton, Ion Torrent PGM (Life Technologies),
  GS FLX+, GS Junior (Roche)
  
  ,
• подготовка образов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования,
• улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР с помощью систем QX100 и QX200 с автоматической системой генерации капель (Bio-Rad),
• выделение НК и белков.

Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.

4 режима программирования:

1. Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.
2. Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
3. Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
4. Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).

3 стратегии детектирования фракций:

• Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
  
• Для ДНК больших размеров (>, 2 тыс. п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
  
• Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (>, 2 тыс. п.н.):
  Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
  

Преимущества метода:

• Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов.
• Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования.
• Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.
• Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.
• Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.

Схема работы:

1. Пробоподготовка:
• Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно - меченного маркера.
• Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.
• В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.
2. Эксперимент:
• Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК,
• помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж),
• По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций пипеточным дозатором.

Информация о свежих статьях:

1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015), Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.
2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454, Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.

Видео:
Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep

Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.